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摘要：日的评价Legg—Perthes病早期关节软骨功能状态及其对该病发展的影响。方珐
选择健康杂种劬犬20只，雌雄不限，采用自身对照方法．任选一侧髋为实验侧，另一侧作为对照。应用TH腔股骨颈内注射法制作Legg-Perthes病动物模型，于注腔后8周、12周时劬犬分批处死取材，观察组织学变化，行软骨基质及软骨下骨蛋白多糖(Pmteoglycan，PG)和碱性磷酸酶(A1．kalineph~phatase，AKP)测定。蛄果随着实验时间延长，关节软骨(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)病变与骨骺坏死病变逐渐加重，实验侧关节软骨增厚，早期即可观察到软骨细胞分布较稀散，软骨深层空缺软骨陷窝明显增多，软骨基质及软骨下骨PG舍量显著下降，软骨下骨AKP活性明显降低。蛄论Legg-Per—thes痛时关节软骨功能早期已有明显障碍，其与股骨头骨骺坏死病
（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））变可相互促进，互相影响。
关键词：Legg-Perthes病；蛋白多糖；砌f生磷酸酶；关节软骨
中图分类号：R681．4 文献标识码：A 文章编号：0258加659(20O2)O2．0155_03
Legg-Perthes病不是单一的骨骺坏死病(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)变．其关节软骨亦会同时累及，本实验在分析软骨基质PG含量变化问时，对软骨下骨的PG含量和AKP活性进行探讨，以分析该病时关节软骨(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)功能状态改变及关节软骨病变与骨骺坏死之间的相互影响关系。
1 材料和方法
1．1 动物分组选健康杂种幼犬2O只，体重3～5 kg，雌雄不限，采用自身对照方法，任选一侧髋为实验侧，另一侧作为对照。
1．2 模型制作
幼犬腹腔内注药全麻后，仰卧位固定无菌操作，实验侧驱血带驱血后放射监控下应用骨穿刺套针经皮于大转子下方向股骨颈中央穿刺达股骨头颈部(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)骺板远侧，注人医用TH胶1mL。术后相同条件下分笼饲养，给予充足活动空问，注胶后8周、12周时分批处死取材。
1．3组织病理学检查动物处死后立即取出股骨头及干骺端(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)，沿冠状面正中剖开，留关节软骨及骨骺标本行常规病理检查。
1．4 PG含量测定
取全层软骨标本丙酮酒精固定，PAS反应方法行PG染色，光镜观察。阳性反应处呈红色或紫红色，核兰色。PC,对照染色取材、固定方法相同，切片脱蜡至水后用10
g·L(1％)淀粉糖化酶溶液，37℃
，处理40rain，蒸馏水充分洗涤后人PAS反应。PG含量测定方法：以PG对照染色片作为含量为零的基准对照色，用CM]AS病理图象分析系统(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)测定10x4倍视野下(连续选择5个视野，允许
交叉重叠)双侧软骨下骨、软骨基质中PG的积分光密度值，其均值代表PG含量。
1．5 AKP活性测定 全层软骨标本固定于80％(体积比)酒精，4℃ ，8 h。AKP显示应用钙钴法，光镜观察酶活性处为灰黑色或黑色沉淀。AKP对照染色取材、固定方法相同，仍以钙钴法显示，仅在操作步骤中去掉底物(肛甘油磷酸钠)。AKP计量方法：以AKP对照片作为活性为零的基准对照色，用CMIAS病理图象分析系统
（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））测定l0x4视野下(连续选择5个视野，允许交叉重叠)AKP积分光密度值，均值代表AKP活性。
1．6 统计学处理实验数据以均数±标准差(j± )表示，经SPSS 10．0for
windows软件统计分析，t检验．P<0．05为统计学上相差显著。
2 结 果
2．1
病理组织学观察实验第8周时，病理组织学大体形态未见明显变化。第12周时，实验侧股骨头连同干骺端未发现股骨头变形(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）)．关节软骨面光滑．无软骨坏死及剥脱，其病理变化仅表现为骨质硬度下降，易于凿切，关节软骨普遍增厚，剥离较容易，表面色泽较对照侧发暗。光镜观察对照侧见骨骺骨小粱中骨细胞清晰可见，核较大，位于中央。关节软骨细胞排列规则，极少见到空缺软骨陷窝．软骨下骨骨小粱粗大、密集，骨骺内微循环
（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））畅通实验侧：第8周时股骨头骨组织内见髓腔脂肪组织增多，造血细胞数城少，部分骨陷窝中骨细胞消失，关节软骨细胞排列欠规则，可见软骨深层空缺软骨陷窝；第12周时，以上变化更加明显，空缺骨陷窝明显增多，骨小粱变得细、疏，关节软骨细胞排列散乱，深层空缺软骨陷窝明显多见，软骨下骨可见微骨折，骨骺内微循环
（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））呈现淤血状态。
2．2 PG、AKP组化染色及羽J定 对照例关节软骨基质及软骨下骨基质PG浓染，呈红色或紫红色；软骨下骨AKP染黑色，酶颗粒较大或密布呈黑色片状。实验例无论PG或AKP染色均较对照侧变淡，且随着实验进展更趋明显，计量测定结果见表1，2。
3 讨 论
3．1 PG及AKP的生物学功能、台量改变与原因生物学功能：④PG是软骨基质中一种主要有机成分，是骨基质中的重要有机成分，除对骨与软骨细胞(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）)有支持和保护作用外，还对其生长、发育、分化和运动有着密切关系。PG对维持软骨的形态、体积和机械稳定性，保证软骨的抗压缩能力、吸收震动、耐摩擦等功能及调节软骨的物质代谢(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)，阻止细胞、抗体粘附和关节面血管翳的形成起着重要作用
，因而PG 的含量反映着关节软骨的功能状态。② 骨组织中AKP主要位于骨基质及成骨细胞胞浆内(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）)，在软骨基质颗粒与成熟软骨细胞浆膜中亦含有大量AKP
。成熟的软骨细胞和成骨细胞是骨形成过程中最重要的功能细胞(脑微循环（动物）)，所以骨AKP不仅是成熟软骨细胞和成骨细胞的重要表面标志，也是骨形成的标志
】。在新骨形成较活跃的部位，AKP活力强。PG含量与AKP活性的改变与原因：有研究发现骨关节炎患者有患髋软骨PC-含量下降的生化表现
J，但本实验在第8周时，即Legg-Perthes病早期井无骨关节炎存在的情况下，实验侧关节软骨基质及软骨下骨PG含量较对侧已有统计学意义上的显著下降(表1)，不但说明Legg-Perthes病早期已存在关节软骨功能障碍(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)，也说明骨骺坏死本身可导致软骨PG含量改变。第12周时，实验侧关节软骨普遍增厚，软骨PG含量下降较第8周时更为明显(表2)，提示随着骨骺坏死的加重及病程进展，关节软骨功能障碍也日趋加重。造成PG含量下降的因素考虑有以下几种
①
血供因素：本实验的病理组织学观察结果表明软骨下骨存在微骨折(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)。关节软骨的营养，幼年是从关节滑液及软骨下骨髓血管两方面而来，成熟关节营养主要从关节滑
液而来
。微骨折的发生。使软骨下骨的毛细血管（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））床受压变形，影响深层软骨及软骨下骨的营养供给，加之软骨增厚，深层软骨从关节液中汲取的营养更趋减少，从而导致PG合成减少，含量下降；②血管翳的形成：本实验在取材过程中发现髋关节滑膜增生肥厚，色泽由微黄色至暗红色，侵蚀至关节软骨(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)边缘形成血管翳。血管翳中含有中性蛋白酶、溶酶体酶等
，后者在较低浓度下即可降懈软骨内
的PG，使分懈增加；③
负荷传导紊乱：负荷传导紊乱可致软骨(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）)退变。已成众多学者共识。本实验在骨骺坏死发生后，由于疼痛、跛行等的影响，使压力传导不均衡，产生应力集中，使软骨细胞(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)在过高应力作用下受损，同时，过高的物理应力使关节软骨的“拱形纤维结构”遭受损伤，使其从关节腔液中汲取营养及排出代谢废物功能受到影响，造成软骨细胞受损、变性以至坏死。软骨下骨AKP活性降低的原因一方面是缺血缺氧使软骨(脑微循环（动物）)细胞发育成熟过程受到阻抑，成骨细胞来源减少，另一方面成骨细胞的正常生理活动受到抑制，以致AK生成减少，形成钙化骨能力下降，另一方面缺血缺氧造成的局部酸性代谢环境不利AKP活性的发挥，加之营养毛细血管血流
（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））的减少，使合成AKP的原料供给减少，AKP生成不足。
3．2 PG含量下降及AKP活性降低对Legg．Perthes病发展的影响 本实验中软骨下骨AKP活性降低、PG含量下降使软骨下骨出现不同程度骨形成障碍，其对坏死骨(脑微循环（动物）)的修复能力下降，加之关节软骨PG含量的下降使关节软骨的负重、润滑、吸收震动及耐摩擦、传递负荷功能受损，使软骨下骨质承受的应力明显增加，容易导致微骨折发生。微骨折使骨内毛细血管
（肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF））和窦状隙受压或损伤，产生供血或(和)回流障碍，导致供血和回流间的恶性循环，同时反复的微骨折(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)可阻止坏死区修复过程中再血管化的进行。最终必然导致骨骺缺血坏死加重。而骨骺坏死后不同程度的变扁、塌陷以及疼痛、跛行等因素造成的血供障碍、负荷传导紊乱，亦会反作用于关节软骨本身，使其产生更加严重的功能障碍，两者之间亦形成恶性循环(肾脏微循环（动物）,床边微循环（动物）,脑微循环（动物）,显微影像微循环检测系统（动物）,旁流暗视野（SDF）,侧流暗视野（SDF）)。
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(编辑卓选鹏)
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