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摘要 目的：观察大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)瞬间旋转引起脑神经轴索损伤的形态学改变并探讨其机理。方法：SD大鼠21只(对照组3只，损伤组18只)。采用自制头颅旋转致伤装置，将损伤组大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)于3ms内在冠状面绕脑中心右向旋转90°造成剪力伤，于伤后6、12、24、72、144小时分批处死动物制脑切片，行镀银及HE染色，光镜下观察神经轴索变化。结果：伤后即刻大鼠均意识丧失。3只15分钟内死亡，肉眼亦见蛛网膜下腔广泛出血。其余存活大鼠在伤后6至144小时，肉眼见蛛网膜下腔广泛出血，光镜下见脑干、胼胝体、大脑脚等部的神经轴索有程度不同的肿胀、断裂、轴缩球形成等征象，以脑干纵行纤维受损最重并伴纤维束间点状出血。延髓和中脑的上述变化分别在伤后6及24小时最重。结论：本研究成功地建立了大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)瞬间旋转脑弥漫轴索损伤模型，表明剪力可引起轴索损伤，脑微血管变化是加重轴索损伤的重要因素。
脑弥漫轴索损伤(diffuse axonal injury,
DAI)在重型颅脑(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)损伤中占28%～42%，死亡率高达42%～62%(1，2，3），临床治疗十分棘手。本世纪80年代以后，国外采用颅瞬间旋转装置，复制出狒狒、幼猪DAI动物模型；但发现该二种动物模型中脑轴索损伤的分布形式有明显不同。本研究采用自制的头颅瞬间旋转装置，观察大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)在冠状面绕脑中心瞬间旋转90°后，脑神经轴索的形态学变化，探讨建立大鼠颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)瞬间旋转脑DAI模型的可行性，旨在深入研究DAI致伤机理，并为指导临床诊治提供参考。
材料和方法
一、头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)旋转致伤装置制作
主要结构如下(图1)：
1.固定部分：包括门齿孔、一对横向杆，双侧耳棒。
2.驱动弹簧：由直径4毫米钢丝制成，圈数为6，内径32mm，经烘烤定型后，预先顺时针扭转270°，固定于旋转装置内(其连带之横向杆此时呈上下排列)。
3.回位旋扭：用活动扳子将其顺时针方向拧动90°，可使横向杆由上下排列变为水平排列(此时，将麻醉后大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)经耳棒及门齿孔固定于横向杆上，躯干与实验台成20°角俯卧其上)。
4.扳机：向下按动，弹簧可获释放，固定部分遂带动鼠颅以横向杆连线中心为轴心逆时针转动90°，即相当于大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)于冠状面绕脑中心右向旋转90°。顺时针方向拧动回位旋钮，卸下动物，以备下次使用。
1.扳机 2.回位旋钮 3.驱动弹簧 4.耳棒 5.横向杆 6.门齿孔
二、动物分组与损伤实施
健康雄性SD大鼠21只，体重250～300g。随机分为损伤组18只，对照组3只。各组大鼠用乙醚麻醉后，按前述方法将其头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)固定于旋转装置上，待大鼠麻醉苏醒开始挣扎后，按动扳机。经第四军医大学生物力学教研室测算，整个90°旋转过程用时＜3ms，角速度＞767rad／s，角加速度＞1.87×105rad／s2。正常对照大鼠(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)一旦挣扎，即从装置上卸下。观察各组大鼠行为表现。对意识丧失者，记录旋转后至出现复正体位动作的时间，作为昏迷时程指标。实验中损伤大鼠有3只于旋转后15分钟内死亡，其余15只于伤后6、12、24、72、144小时分批处死(每批3只)，行组织学处理。对照组3只从旋转装置上卸下后6小时处死，行组织学处理。
三、组织学处理
大鼠在预定时间行腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，开胸，主动脉插管。灌注生理盐水至冲净循环系统血液，再灌注10%福尔马林-磷酸盐缓冲液400ml固定组织(以上于20分钟内完成，灌注压12.0～13.3kPa)，立即取全脑，肉眼观察脑部变化。将脑置于10%福尔马林-磷酸盐缓冲液中再固定1周。对照组3只及损伤组每批3只处死动物中，各取2只沿其脑矢状中线切开；另1只在延髓、桥脑、中脑(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)及胼胝体中部平面冠状切开。脑组织行常规脱水、石蜡包埋。矢状块脑由中线向外侧切片，冠状块脑由后向前切片，片厚8μm，隔25片取3片。裱片，烘干，脱蜡至水。2片行Glees-Marsland镀银染色，1片行HE染色。用Olympus光镜观察。伤后早期死亡的3只大鼠，于死后即刻取脑，肉眼观察脑部变化。
四、数据分析
有关数据采用第四军医大学统计学教研室研制的SPLM统计软件进行处理。
结 果
一、伤后行为变化
损伤组大鼠伤后均有原发意识丧失，伴呼吸浅快或深慢。3只于15分钟内死亡。存活者昏迷时间2～25分钟，平均13.5分钟；苏醒后72小时内反应迟钝。对照组大鼠从装置上卸下后，活动如常。
二、伤后脑组织病理变化
(一)大体观察
伤后15分钟内死亡的大鼠在小脑及大脑枕顶部广泛蛛网膜下腔出血，右侧半球(脑向颅底运动)重于左侧(脑向颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)顶运动)，大脑底面有小灶状出血点，无明显脑挫裂区。存活鼠于伤后6～144小时观察见上述出血随时间逐渐吸收。
(二)显微镜观察
1.镀银染色：矢状切片 损伤后6小时，在大鼠(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)延髓腹侧纵行神经轴索之间，空隙增宽，有大量嗜银较强的棕黑色粗大轴索。其走行纡曲，局部扩大如“串珠”，为轴索肿胀(axonal
swelling)征；个别者末端膨出如梭，大小不一，约5～15μ，此即轴缩球(axonal retraction
ball)(图2)。中脑顶盖区纵行神经轴索束间亦见粗大轴索，局部肿胀。在其走行路径上有多处中断，个别断端形成轴缩球(图3)。对照组大鼠(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)延髓、中脑神经轴索排列密集，尽管其直径不尽相同，但差距不大，且表面相对平滑，无轴索肿胀、断裂及轴缩球(图4、5)。伤后12小时，延髓腹侧及中脑顶盖区上述征象继续存在，于胼胝体体部始见少数神经轴索局部增粗。伤后24小时，延髓神经轴索局部肿胀和轴缩球有所减少，但中脑顶盖区轴缩球数量明显增多，胼胝体区亦出现少量轴缩球(图6)。伤后3～6天，延髓、中脑、胼胝体区上述轴索损伤性改变明显减轻，伴发胶质细胞弥漫增生。脑损伤后桥脑腹侧、大脑脚、上下小脑脚、内囊、视束及小脑白质等部散在可见神经轴索轻微肿胀，大脑皮层白质下神经轴索未示明显变化。
冠状切片：各时点观察，仅伤后24小时见中脑顶盖区、伤后3天小脑白质区有少量轴缩球出现。
2.HE染色
神经轴索呈嗜伊红色，轴索肿胀和轴缩球不易同神经元胞体之断面区别。因此，该染色难以用于观察轴索损伤性变化。伤后6～24小时，在延髓及中脑可见多处小出血点。伤后6天，延脑显示广泛小胶质细胞增生，可见小胶质细胞巢落，其中夹杂着双核及分叶核胶质细胞。
一、DAI概念及动物模型
1982年Adams等(5）对一组主要由车祸所致的重型颅脑损伤进行研究。尸检肉眼观无明显的占位病变，光镜下见胼胝体、脑干上端、大脑(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)白质等部广泛神经轴索肿胀、断裂并出现轴缩球；患者多于伤后即刻长时昏迷，其伤情严重程度与轴索变化极为相关。为此，Adams提出DAI概念，来描述这类由外力作用引起的，以脑深部神经轴索变化为病理特征的脑损伤。目前，DAI已被视为一种独立的脑损伤类型；但其发病机理，尚不完全清楚。
建立DAI动物模型，对于深入研究DAI有重要意义。本世纪80年代初，Gennarelli等(6）将狒狒头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)在冠状面于11～22ms旋转60°，在临床及病理上证实复制出酷似人脑DAI的非人灵长类动物模型，并强调了“弥漫施力、瞬间作用、旋转效应”等力学因素在DAI发病中的决定意义。Ross等(7）将幼猪头颅在6ms内于冠状面旋转60°～105°，也证实获得DAI模型。Margulies等(8）根据物理模型研究结果，提出外力大小须使狒狒头颅旋转时的角速度、角加速度分别不低于260rad／s、1×105rad/s2才能促发DAI。传统观点认为动物脑质量越大，颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)瞬间旋转越易引发DAI，故目前罕有小动物(如大鼠)颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)旋转DAI模型的报道。
本研究中，大鼠头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)于3ms内在冠状面旋转90°，脑部角速度＞767rad/s，角加速度＞1.87×105rad/s2，二者均大于Margulies报告的DAI力学参数阈值。伤后大鼠全部出现昏迷，伴呼吸节律紊乱，个别者于15分钟内死亡，死亡率17%，可能因中枢性呼吸功能衰竭所致。存活者原发昏迷持续时间可长达25分钟。伤后6小时至6天镀银染色光镜下见延髓、中脑、胼胝体、小脑白质、桥脑、大脑脚、小下小脑脚、内囊等广泛区域有分布不匀、程度不一的神经轴索局部肿胀和(或)轴缩球，伤后6天在脑干存在胶质细胞肥大及增生性改变。可见，本大鼠模型具有DAI一般特征。
二、DAI发生的时、空特征
在人类DAI及非人灵长类动物颅旋转DAI模型中，轴索肿胀及轴缩球等征象多见于胼胝体、内囊、脑干上端及大脑白质(5,6,9）。Ross等(7）的幼猪DAI模型中，轴索损伤主要居于大脑白质浅层。Povlishock(10）指出，小动物轴索损伤好发于脑干。本研究中，大鼠颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)旋转DAI在病理上也集中在脑干内，在临床上除表现为意识障碍外，尚伴有呼吸节律紊乱等其它脑干机。
附表 伤后不同时间大鼠各脑区轴缩球密度(个／160×160μ2)(±s)
能异常。可见，病理与临床表现是一致的。轴索损伤的分布，与物种间颅脑(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)解剖结构不同有关。灵长类动物有坚硬的大脑镰，因而头颅加-减速运动时，镰下的胼胝体极易受累。
文献表明，人脑轴缩球出现于伤后12小时以上，动物轴缩球出现较早，但幼猪DAI模型中此期不短于6小时(7）。本研究中大鼠伤后6小时在延髓腹侧及中脑顶盖区即见大量轴索肿胀和轴缩球；延髓轴缩球密度以伤后6小时最高，随时间逐减，中脑在伤后24小时轴缩球密度达峰值；胼胝体仅在伤后24～72小时出现少量轴缩球。各时点综合分析，见轴缩球密度在延髓、中脑、胼胝体呈递减之势。
三、DAI致伤机理
前述的轴索损伤时、空特征，证实DAI是由剪力致伤之后引起的、呈规律性演变的一个过程，因此应属于继发性损伤，轴索的改变并非在伤后立即出现。头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)瞬间旋转使脑在惯性驱导下作非线性加-减速运动，其间产生一种与旋转轴相垂直的剪切力。这一剪力作用于桥静脉，引起蛛网膜下腔出血；作用于脑实质微血管，可致脑组织内点状出血；作用于神经纤维，则致轴索损伤。Maxwell等(11）扫描电镜研究证实，狒狒头颅(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)瞬间旋转后血脑屏障存在明显异常。本研究中损伤鼠也表现有蛛网膜下腔出血及脑实质内点状出血。这表明，颅内血管改变是伴随轴索损伤的一个重要因素；提示，及早改善脑微循环(大鼠头颅微血管,大鼠微血管)，在DAI的临床救治中似应具有一定裨益。
参考文献
1 Adams JH, Gennarelli TA, Maxwell Wl. Diffuse axonal injury in
nonmissile head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry,
1991,54:481-483.
2 Bennett M. Clinicopathologic observations in 100 consecutive
pattens with fatal head injury admitted to a neurosurgical unit.
Ir Med J, 1995,88:59-62.
3 赵孟尧，过宗南，刘建民，等.脑弥漫轴索损伤.中华神经外科杂志，1991；7：93-95.等文章
作者单位：710032 西安，第四军医大学西京医院神经外科 |
