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【摘要】目的探讨利多卡因与神经生长因子(NGF)预处理对脑缺血／再灌注(I／R)损伤神经细胞凋亡的影响。方法将54只蒙古种沙土鼠按随机数字表法分为正常对照组(A组)、利多卡因对照组(L组)
、NGF对照组(N组)、利多卡因预处理12、24、48 h组(L12、L24、L48组)和NGF预处理12、24、48 h组
(N12、N24、N48组)9组，每组6只。除A组外，各组均夹闭双侧颈总动脉20 min后再松夹，造成I／R损伤模型
。采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测海马CAl区神经细胞凋亡数，采用免疫组化法检测海马CAl区Bcl一2
、Bax表达的阳性细胞数。结果利多卡因与NGF不同时间预处理组CAl区神经细胞凋亡数(个：L12组32．87
士0．99，L24组31．90士4．14，L48组24．50士0．70；N12组32．80士1．27，N24组32．83士1．30，N48组23．30士O．86)和Bax阳性细胞数(个：L12组33．47士1．21，L24
33．70士1．20，L48组24．67士2．09 ；N12组32．17士2．21，N24组31．97士1．79，N48
h组23．27土1．20)均较相应对照组[细胞凋亡数(个)：L组67 ．43士3．92，N
组67．80士3．82；Bax阳性细胞数(个)：L组59．73士1．32，N组59．37士1．54]显著减少，而Bcl一2阳性细胞数(个：L12组36．60士3．31，L24组34．73士1．82，L48组65．17士1．53；N12组35．70士1．18
，N24组37．30±3．86，N48组62．77士2．91)则较相应对照组(个：L组24．53士1．48，N组2S．43士1．85)显著增加(P<O．05P<O．01)；其中48
h组较12 h组和24
h组作用更显著；而两个预处理组间不同时间凋亡细胞、Bcl一2、Bax的表达比较差异均无统计学意义。结论利多卡因与NGF预处理均可减轻脑I／R损伤引起的神经细胞凋亡，具有脑保护作用
（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）），以缺血前48
h预处理效果明显，机制可能与Bc卜2及Bax表达有关。
【关键词】利多卡因， 神经生长因子； 预处理I 缺血／再灌注损伤，脑；脑保护(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)
已知神经元凋亡是脑缺血／再灌注(I／R)后迟发性神经细胞损伤的重要形式之一。Bcl一2是一个与细胞存活有关的基因，其表达增加可导致缺血神经元发生凋亡。本实验中用利多卡因与神经生长因子(NGF)对脑I／R损伤沙土鼠进行预处理，观察再灌注后Bcl一2、Bax的表达及神经元凋亡情况，探索其对I／R损伤的保护作用及第二效应时间窗，并比较两者的脑保护
（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物））作用。
1材料与方法
1．1 主要试剂：盐酸利多卡因注射液，NGF，Bcl一2、Bax免疫组化试剂盒及原位末端缺刻标记法(TUNEL)原位细胞凋亡检测试剂盒。
1．2方法：成年蒙古种沙土鼠54只，体重50～85
g，按随机数字表法分为9组，即假手术组(A组)、利多卡因对照组(L组)、NGF对照组(N组)、利多卡因预处理组(L12、L24、L48组)和NGF预处理组(N12、N24、N48组)，每组6只。药物预处理方法：L12、L24、L48组分别在脑缺血前12、24和48
h腹腔注射质量分数为2％的利多卡因20 mg／kg，L组用相同方法给予等量生理盐水(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)；N12、N24、N48组分别在脑缺血前12、24和48
h按文献[1‘23方法经侧脑室注入NGF 0．05 g／L,N组用相同方法注入等量无菌人工脑脊液。
1．3 I／R动物模型制备：腹腔注射戊巴比妥麻醉动物后，分离双侧颈总动脉，用无创微动脉夹夹闭，20
min后松夹使双侧颈总动脉血流再灌注。A组不行I／R处理，其余操作相同。缺血过程中，未出现昏迷、癫痫、抽搐等并发症的动物均予以剔除【3]。
1．4标本的取材及处理：再灌注24 h麻醉动物，按文献[4]方法，断头取脑，从视交叉后1 mm及5
mm处冠状面切开鼠脑（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）），取中间块放入相同固定液中继续固定24
h。组织块行常规水洗、脱水、苯酚浸泡、石蜡包埋，连续切成4弘m厚的切片。
1．5阳性细胞检测
1．5．1 凋亡细胞检测：采用TUNEL法，操作程序按试剂盒说明书进行，3，37一二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素轻度复染；阴性对照不加脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)；阳性对照为试剂盒中提供的已知TUNEL阳性切片。TUNEL阳性细胞为细胞核中出现棕黄色颗粒。
1．5．2 Bcl一2、Bax蛋白检测：采用免疫组化PV一6001二步法，按试剂盒说明书进行操作；阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，其余步骤相同；阳性对照为试剂盒中提供的已知Bcl一2、Bax蛋白染色阳性标本切片。Bcl—2和Bax阳性细胞为胞质出现棕黄色颗粒。
1．5．3图像分析：采用细胞图像分析系统(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)对切片进行分析。在光镜下(×400)直接计数海马CAl区5个视野的凋亡细胞及Bcl一2、Bax阳性细胞，每个视野总细胞数不少于100个。
1．6统计学处理：应用SPSS
11．5统计软件，数据以均数士标准差(z土5)表示，采用单因素方差分析，两组数据比较采用￡检验，多组数据的两两比较采用g检验；P<O．05为差异有统计学意义。
2结果
A组海马CAl区TUNEL、Bax、Bcl一2染色呈阴性表达。表1及彩色插页图l～3结果显示，利多卡因与NGF预处理组间相应时间点神经细胞凋亡数和Bcl一2、Bax阳性细胞数差异均无统计学意义(均P>O．05)。利多卡因及NGF预处理各时间点组较相应对照组CAl区神经细胞凋亡数、Bax阳性细胞数显著减少，Bcl一2阳性细胞数显著增加，以预处理48
h最显著(P<O．05或P<O．01)。利多卡因与NGF预处理各时间点组间比较，48
h组比其他时间组CAl区神经细胞凋亡数、Bax阳性细胞数显著减少，而Bcl一2阳性细胞数显著增加(均P<0．05)。
裹l各组动物脑缺血／再灌注后凋亡细胞数及Bax、Bcl一2阳性细胞数比较(；±s)
注：L、L12、L24、L48组；利多卡因对照组及缺血前12、24、48 h
预处理组，N、N12、N24、N48组：神经生长因子对照组及缺
血前12、24、48 h预处理组，与相应L组或N组比较，‘P<
O．05，6P<O．ol，与相应L48组或N48组比较，。P<o．05
3讨论
3．1预处理与I／R损伤：预处理是一定的损伤或刺激触发机体组织内源性抗损伤机制，以减轻后续损伤的现象。1986年Murry等Ⅲ最初提出缺血预处理对心脏I／R损伤有保护作用(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)。1990年Kitagawa等¨j证实脑缺血预处理可以诱导脑对缺血的耐受。预处理的保护效应具有时相性，这种效应可在处理后即刻发生并持续数小时，也可以发生于预处理后更长时间，即延迟保护作用，称为保护作用的“第二窗口”。本实验中分别在沙土鼠脑缺血前12、24、48
h给予利多卡因或NGF预处理，结果发现与相应I／R对照组比较，预处理各组对沙土鼠脑I／R诱导的神经细胞凋亡均有明显的抑制作用，其中以预处理48
h组效果最为明显，这可能与保护作用的第二时间窗效应有关。
3．2 I／R损伤与细胞凋亡：许多研究显示细胞凋亡是脑I／R迟发性损伤的主要形式之一。Renolleau等L7一研究表明脑I／R损伤可诱导神经元凋亡。细胞发生凋亡时DNA迅速被核酸内切酶降解，产生长180～200
bp或其倍数的寡核苷酸碎片，这是细胞凋亡的一个显著特征，是细胞凋亡的最可靠指标。细胞凋亡的发生机制可能与氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤等因素共同作用有关。本实验中TUNEL
染色检测凋亡细胞结果提示，假手术组未见阳性凋亡细胞；而各预处理组及I／R对照组均可见凋亡细胞，尤以I／R对照组更为显著。这可能与I／R引起细胞内钙超载、自由基生成增多、游离脂肪酸增多及兴奋性氨基酸释放增加有关。
3．3 Bcl一2的抗凋亡及Bax的促凋亡作用：＆l一2基因是在1984年由Tsujimoto等∞3从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因。首先，Bcl一2蛋白与细胞器(尤其是线粒体外膜，核被膜、内质膜
，旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)上相关联的稳定蛋白C一末端疏水性氨基酸结合，使其活性下降，通过其BH3结构域与Bcl一2家族的促凋亡蛋白形成异源二聚体，从而维持促凋亡成员在细胞内的定位分布，保护细胞不进入凋亡程序；其次，高浓度的Bcl一2可抑制正在凋亡的细胞内质网中Ca2+释放。Murphy等p3研究发现，Bcl一2通过抑制钙超载并提高对高钙的耐受性来抑制细胞凋亡。另外，Bcl一2直接或间接与细胞信号转导蛋白(如P53)结合而调控凋亡。Bcl一2也有抗氧化作用，抑制自由基的产生，调节细胞的氧化还原状态，抑制细胞内反应性氧自由基的生成及活性；同时还可诱导细胞内源性抗氧化剂的表达，保护其活性，清除氧自由基。
细胞凋亡发生与否和Bcl—2表达量有关。Chen等[1们研究发现，Bcl一2基因缺乏鼠脑缺血(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)后梗死体积增大、神经功能缺损增加，且与基因缺乏程度相关，而转基因方法使细胞Bcl一2蛋白表达增加，在体外及体内均可保护神经元免受多种有害因素引起的损害或减轻损害。Ferrer等口¨研究发现，脑I／R发生后，Bcl一2的表达有一定时间效应。徐忠信等[12]研究发现，细胞凋亡、Bcl—xL和Bax表达于I／R后24～48
h达高峰。本实验结果显示，Bcl—2表达高的利多卡因及NGF预处理各组凋亡细胞减少，尤其是预处理48
h组更为明显，与徐忠信等报道相一致。Bax是一个促进凋亡的亚族，其与Bcl一2有很高的同源性，主要存在于胞质。近年来发现Bcl一2还可以与Bax结合，Bax表达水平增加可拮抗Bcl一2的作用，促进凋亡n引。Bax与Bcl—2形成异源二聚体，抑制Bcl一2活性，使凋亡易于发生。有学者认为，在生理情况下，Bax可能在膜上形成通道，从而导致细胞凋亡，而Bcl一2能通过与Bax结合抑制Bax所致的凋亡。脑缺血后Bcl一2、Bax表达与神经细胞存活有密切关系。Bax占优势时促进细胞死亡，Bcl一2占优势时阻止细胞死亡[1引。由此可见，Bax与Bcl一2在细胞凋亡过程中存在相互作用，而且两种相似蛋白的聚合作用可能是调节细胞功能的共同机制。本实验结果显示，在Bax表达高的I／R对照组凋亡细胞明显增多。而Bcl一2／Bax比值高的预处理各组较比值低的I／R对照组凋亡细胞减少。
3．4利多卡因与NGF的脑保护（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物））作用：利多卡因是一种临床上应用比较广的酰胺类局麻药，近年来在动物实验
（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物））中发现，利多卡因为一种潜在的神经保护剂，对缺血、缺氧脑功能的改善及脑细胞结构和生化的稳定具有重要作用[1引。本课题组前期的研究显示，1～10弘mol／L的利多卡因对谷氨酸所致大鼠大脑皮质神经元损伤
（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物））具有保护作用[1
6|。NGF是最早被发现的一种神经元营养因子，具有提高神经递质活性，促进多种合成代谢，调节神经元代谢与生存环境，维持其存活、生长、分化、再生和成熟，增加神经细胞的体积，刺激神经轴突的增生和定向生长等生物学效应[1川。本研究结果提示，利多卡因和NGF预处理均可引起Bcl一2表达增加，并降低Bax表达，减少了细胞凋亡的发生，从而产生神经细胞保护作用，两者结果无明显差异。利多卡因和NGF预处理对沙土鼠的保护作用均存在一定的时间效应。本研究提示，在缺血前48
h对沙土鼠先给予利多卡因和NGF预处理，对增强Bcl一2的表达及抑制Bax的表达作用最明显，其具体机制目前还未明确。鉴于细胞凋亡的调控是多因素的，因此利多卡因及NGF(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)是否还存在其他调控细胞凋亡的机制需要进一步探讨。
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(收稿日期：2009一08—18)
(本文编辑：李银平)
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比利时学者最近对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)选择性抑制剂BYKl91023和去甲肾上腺素(NE)治疗脓毒性休克(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)的效果进行了比较。研究人员将24只母羊麻醉后进行机械通气，并按1．5 g／kg向腹腔内注入粪便制备脓毒症动物模型，将制模成功的动物随机均分为NE组、BYK组和NE+BYK联合组3组(，l=8)，用侧流暗视野显微镜监测舌下微循环
（旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物））。结果显示：联合组的平均动脉压和肾血流量均高于其他两组，但心排血指数和全身血管阻力3组间无明显差异。与NE组相比，BYK组肠系膜血流量和氧合指数增加，但平均肺动脉压和血乳酸均降低。发生腹膜炎18 h后，BYK组有效微血管密度和灌流血管比例均高于NE组。3组动物生存期无明显差异。研究人员认为，在改善脓毒症患者的肺动脉压、气体交换、肠系膜血流量、微循环(旁流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测仪（动物）,侧流暗视野显微观测系统（动物）,旁流暗视野显微观测系统（动物）)和血乳酸方面，选择性iNOS抑制剂的效果好于NE；两者联合能够提高平均动脉压和肾血流量。
杨明星，编译自《Shock》，2010—02—10(电子版)；胡森，审校 |
